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1樓
高效液相色譜法經(jīng)典色譜法基礎上引用了氣相色譜理論技術上流動相改高壓輸送（高輸送壓力達4.9107Pa）;色譜柱特殊方法用小粒徑填料填充而成從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)達幾萬或幾十萬）；同時柱連有高靈敏度檢測器對流出物進行連續(xù)檢測
特點
1．高壓：液相色譜法液體流動相（稱載液）液體流經(jīng)色譜柱受阻力較大了迅速地通過色譜柱必須對載液施加高壓般達150～350×105Pa
2. 高速：流動相柱內流速較經(jīng)典色譜快得多般達1～10ml/min高效液相色譜法所需分析時間較之經(jīng)典液相色譜法少得多般少于 1h
3. 高效：近來研究出許多新型固定相使分離效率大大提高
4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度檢測器進步提高了分析靈敏度熒光檢測器靈敏度達10-11g另外用樣量小般幾微升
5.適應范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法比較：氣相色譜法雖具有分離能力好靈敏度高分析速度快操作方便等優(yōu)點受技術條件限制沸點太高物質或熱穩(wěn)定性差物質都難于應用氣相色譜法進行分析而高效液相色譜法只要求試樣能制成溶液而需要氣化因此受試樣揮發(fā)性限制對于高沸點、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大（大于 400 上）有機物（些物質幾乎占有機物總數(shù) 75% ～ 80% ）原則上都應用高效液相色譜法來進行分離、分析 據(jù)統(tǒng)計已知化合物能用氣相色譜分析約占20%而能用液相色譜分析約占70～80%
高效液相色譜按其固定相性質分高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜及高效聚焦液相色譜等類型用同類型高效液相色譜分離或分析各種化合物原理基本上與相對應普通液相層析原理相似其同之處高效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復性好且須色譜儀進行
高效液相色譜法主要類型及其分離原理
根據(jù)分離機制同高效液相色譜法分下述幾種主要類型：
1 ．液 — 液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography)
流動相和固定相都液體流動相與固定相之間應互相溶（極性同避免固定液流失）有明顯分界面當試樣進入色譜柱溶質兩相間進行分配達平衡時服從于下式：
式cs—溶質固定相濃度；cm--溶質流動相濃度； Vs—固定相體積；Vm—流動相體積LLPC與GPC有相似之處即分離順序取決于KK大組分保留值大；也有同之處GPC流動相對K影響大LLPC流動相對K影響較大
a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相極性小于固定液極性
b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相極性大于固定液極性
c. 液 — 液分配色譜法缺點：盡管流動相與固定相極性要求完全同固定液流動相仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時機械沖擊力會造成固定液流失上世紀70年代末發(fā)展化學鍵合固定相（見）克服上述缺點現(xiàn)應用廣泛（70~80%）
2 ．液 — 固色譜法
流動相液體固定相吸附劑（硅膠、氧化鋁等）根據(jù)物質吸附作用同來進行分離其作用機制：當試樣進入色譜柱時溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性心發(fā)生競爭吸附（未進樣時所有吸附劑活性心吸附S）表示下：
Xm + nSa ====== Xa + nSm
式：Xm--流動相溶質分子；Sa--固定相溶劑分子；Xa--固定相溶質分子；Sm--流動相溶劑分子
當吸附競爭反應達平衡時：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式：K吸附平衡常數(shù)[討論：K越大保留值越大]
3 ．離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography)
IEC離子交換劑作固定相IEC基于離子交換樹脂上電離離子與流動相具有相同電荷溶質離子進行逆交換依據(jù)些離子交換劑具有同親和力而們分離
陰離子交換劑例其交換過程表示下：
X-(溶劑) + (樹脂-R4N+Cl-)=== (樹脂-R4N+ X-) + Cl- (溶劑)
當交換達平衡時：
KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]
分配系數(shù)：
DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]
[討論：DX與保留值關系]
凡溶劑能夠電離物質通常都用離子交換色譜法來進行分離
4 ．離子對色譜法(Ion Pair Chromatography)
離子對色譜法種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反離子 ( 稱對離子或反離子 ) 加流動相或固定相使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物從而控制溶質離子保留行其原理用下式表示：
X+水相 + Y-水相 === X+Y-有機相
式：X+水相--流動相待分離有機離子（也陽離子）；Y-水相--流動相帶相反電荷離子對（氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X+Y---形成離子對化合物
當達平衡時：
KXY = [X+Y-]有機相/[ X+]水相[Y-]水相
根據(jù)定義分配系數(shù)：
DX= [X+Y-]有機相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相
[討論：DX與保留值關系]
離子對色譜法(特別反相)發(fā)解決了往難分離混合物分離問題諸酸、堿和離子、非離子混合物特別些生化試樣核酸、核苷、生物堿及藥物等分離
5 ．離子色譜法(Ion Chromatography)
用離子交換樹脂固定相電解質溶液流動相電導檢測器通用檢測器消除流動相強電解質背景離子對電導檢測器干擾設置了抑制柱試樣組分分離柱和抑制柱上反應原理與離子交換色譜法相同
陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相分離陰離子（Br-）例當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時發(fā)生下交換反應（洗脫反應交換反應逆過程）：
抑制柱上發(fā)生反應：
R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O
R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-
見通過抑制柱洗脫液轉變成了電導值小水消除了本底電導影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應酸H+Br-用電導法靈敏檢測
離子色譜法溶液陰離子分析佳方法也用于陽離子分析
6 ．空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography)
空間排阻色譜法凝膠 (gel) 固定相類似于分子篩作用凝膠孔徑比分子篩要大得多般數(shù)納米數(shù)百納米溶質兩相之間靠其相互作用力同來進行分離而按分子大小進行分離分離只與凝膠孔徑分布和溶質流動力學體積或分子大小有關試樣進入色譜柱隨流動相凝膠外部間隙及孔穴旁流過試樣些太大分子能進入膠孔而受排阻因此直接通過柱子首先色譜圖上出現(xiàn)些小分子進入所有膠孔并滲透顆粒些組分柱上保留值大色譜圖上出現(xiàn)
高效液相色譜儀主要有進樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、．分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)下面分別敘述其各自組成與特點
1．進樣系統(tǒng)
般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作進樣量恒定對提高分析樣品重復性有益
2．輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分高壓泵般壓強l．47～4．4X107Pa流速調且穩(wěn)定當高壓流動相通過層析柱時降低樣品柱擴散效應加快其柱移動速度對提高分辨率、回收樣品、保持樣品生物活性等都有利流動相貯存錯和梯度儀使流動相隨固定相和樣品性質而改變包括改變洗脫液極性、離子強度、PH值或改用競爭性抑制劑或變性劑等使各種物質（即使僅有基團差別或同分異構體）都能獲得有效分離
3.分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等色譜柱般長度10～50cm（需要兩根連用時二者之間加連接管）內徑2～5mm由"優(yōu)質銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成住內裝有直徑5～10μm粒度固定相（由基質和固定液構成）．固定相基質由機械強度高樹脂或硅膠構成們都有惰性（硅膠表面硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑達1000?）和比表面積大特點加之其表面經(jīng)過機械涂漬（與氣相色譜固定相制備樣）或者用化學法偶聯(lián)各種基因（磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈烷基等）或配體有機化合物因此類固定相對結構同物質有良好選擇性例多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）把成纖維細胞種糖蛋白分離出來
另外固定相基質粒小柱床極易達均勻、致密狀態(tài)極易降低渦流擴散效應基質粒度小微孔淺樣品微孔區(qū)內傳質短些對縮小譜帶寬度、提高分辨率有益根據(jù)柱效理論分析基質粒度小塔板理論數(shù)N越大也進步證明基質粒度小會提高分辨率道理
再者高效液相色譜恒溫器使溫度從室溫調60C通過改善傳質速度縮短分析時間增加層析柱效率
4．檢測系統(tǒng)
高效液相色譜常用檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種
（1）紫外檢測器
該檢測器適用于對紫外光（或見光）有吸收性能樣品檢測其特點：使用面廣（蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均使用）；靈敏度高（檢測下限10-10g／ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化敏感；檢測梯度溶液洗脫樣品
（2）示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率同樣品組分均使用示差折光檢測器檢測目前糖類化合物檢測大多使用此檢測系統(tǒng)系統(tǒng)通用性強、操作簡單靈敏度低（檢測下限10-7g／ml）流動相變化會引起折光率變化因此既適用于痕量分析也適用于梯度洗脫樣品檢測
（3）熒光檢測器
凡具有熒光物質定條件下其發(fā)射光熒光強度與物質濃度成正比因此檢測器只適用于具有熒光有機化合物（多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）測定其靈敏度高（檢測下限10-12～10-14g／ml）痕量分析和梯度洗脫作品檢測均采用
（5）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
該系統(tǒng)對測試數(shù)據(jù)進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作使樣品分離、制備或鑒定工作能正確開展
知識庫標簽：
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