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這種磷酸化與電子的轉(zhuǎn)遞鏈無(wú)關(guān)。
指在分解代謝過(guò)程中，底物因脫氫、脫水等作用而使能量在分子內(nèi)部重新分布，形成高能磷酸化合物，然后將高能磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到ADP形成ATP的過(guò)程。例如在糖的分解代謝過(guò)程 底物水平磷酸化中，甘油醛-3-磷酸脫氫并磷酸化生成甘油酸-1，3-二磷酸，在分子中形成一個(gè)高能磷酸基團(tuán)，在酶的催化下，甘油酸-1，3-二磷酸可將高能磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)給ADP，生成甘油酸-3-磷酸與ATP。 　
又如甘油酸-2-磷酸脫水生成烯醇丙酮酸磷酸時(shí)，也能在分子內(nèi)部形成一個(gè)高能磷酸基團(tuán)，然后再轉(zhuǎn)移到ADP生成ATP。
而氧化磷酸化是在呼吸鏈電子傳遞過(guò)程中偶聯(lián)ATP的生成。生物體內(nèi)95%的ATP來(lái)自這種方式。